El nacimiento de la ciudad y la evolución de su espacio urbano se exponen en la primera parte de la Sala Colonia, los antecedentes de la fundación y traslado de Santiago de Guayaquil y el rol de los conquistadores hispanos que intervinieron en este hecho histórico: Diego de Almagro, Sebastián de Benalcázar, Francisco de Orellana y Diego de Urbina.
Varios planos antiguos, ilustraciones, dioramas y dos maquetas a escala (1687 y 1772) reconstruyen los primeros siglos de la evolución urbana de Guayaquil y la conformación de los sectores históricos conocidos como Ciudad Nueva, Ciudad Vieja y el Barrio del Bajo.
La segunda parte de la Sala Colonia exhibe varios objetos coloniales (cerámica, monedas, armas de fuego) y al mismo tiempo relata los aspectos más destacados de nuestra historia bajo la Corona de España, entre ellos la producción y el comercio, la actividad de los astilleros, la obra pública y las grandes adversidades que marcaron nuestra vida en ese entonces, tales como las invasiones piráticas, los incendios y las pestes.
En esta sala está la maqueta a escala de la manzana donde se encontraba la «Casa de las Temporalidades» (1750) que fuese propiedad de la Compañía de Jesús; el conjunto arquitectónico comprendía la iglesia de Nuestra Señora de la Soledad, el colegio San Francisco Javier y la primera torre con reloj público de la ciudad.
La sala incluye la galería de retratos de los gobernadores coloniales (Juan Antonio Zelaya, Ramón García de León y Pizarro, Jacinto Bejarano y Lavayen, Bartolomé Cucalón y Villamayor, entre otros). También nos recuerda a los guayaquileños más notables del período como Juan Bautista Aguirre y Pedro Franco Dávila.
Colección de monedas y medallas antiguas del período republicano de nuestro país.
Retratos de los Presidentes Constitucionales de la República Ecuador, expuestos en orden cronológico desde el Gral. Juan José Flores hasta el Dr. Alfredo Palacio. Destacan los retratos recientes de la autoría de Angeloni Tapia y Roberto Saavedra Walker.
Se relatan los antecedentes de la Revolución de Octubre y se hace una reseña cronológica de los acontecimientos durante los días previos al 9 de Octubre de 1820.
Inicia con una Sección Introductoria a la milenaria zona cultural del golfo de Guayaquil y la cuenca del Guayas, sus maravillosos paisajes, su flora y fauna vistos por los expedicionarios científicos de la época colonial.
El recorrido histórico de Guayaquil continúa en estas salas, teniendo como hechos protagónicos: El nacimiento de la república e impulso de la región bajo la administración del Gobernador Don Vicente Rocafuerte, la Revolución del 6 de Marzo de 1845, el bloqueo de Guayaquil de 1859, la Revolución Liberal y el Gran Incendio de 1896, entre los más relevantes del siglo XIX.